Los microorganismos son obicuos, por lo que la preparación de un cultico puro implica no sólo el aislamiento de un determinado microorganismo a partir de una población microbiana natural mixta, sino también el mantenimiento del individuo aislado y de su descendencia, en un ambiente artificial al que se le impide el acceso de otros microorganismos. Los microorganismos no requieren mucho espacio para su desarrollo; de ahí que pueda crearse un ambiente artificial dentro de los confines de un tubo de ensayo, de un matraz o de una placa de Petri, los tres tipos de recipientes más comúnmente utilizados para cultivar microorganismos. El recipiente de cultivo debe de estar inicialmente estéril y después de la introducción del tipo de microorganismo deseado debe estar protegido de una posterior contaminación externa. La superficie externa de un recipiente de cultivo está sometida a contaminación y el interior del matraz o del tubo puede contaminarse cuando se abre para introducir o retirar el material. Esto se evita pasando el orificio por una llama de mechero, inmediatamente después de retirar el tapón y, de nuevo, justo antes de volverlo a colocar.
El inóculo, se introduce normalmente con un hilo de metal o “asa” que es rápidamente esterilizada en una llama, inmediatamente antes de ser utilizada. La transferencia de cultivos líquidos puede hacerse también con pipetas. Para este fin, el extremo de la pipeta por donde se aspira se tapona con algodón y la pipeta se esteriliza envuelta en papel o dentro de recipientes metálicos o de vidrio, que mantienen tanto la superficie externa como la interna, libres de contaminación hasta el momento de su utilización.
Este método implica la separación y la inmovilización de los microorganismos particulares sobre o dentro de un medio nutritivo solidificado por agar o algún otro agente gelificante adecuado. Cada organismo viable da origen, al multiplicarse, a una colonia de la cual pueden hacerse tranferencias fácilmente.
La siembra por estría es, en general, el método más útil de sembrar en placa. Un alambre con un aro en la punta, se esteriliza e introduce en una suspensión, convenientemente diluida, de organismos y se utiliza luego para hacer una serie de estrías paralelas, no superpuestas, sobre una placa de agar previamente solidificada.
La siembra por estría es, en general, el método más útil de sembrar en placa. Un alambre con un aro en la punta, se esteriliza e introduce en una suspensión, convenientemente diluida, de organismos y se utiliza luego para hacer una serie de estrías paralelas, no superpuestas, sobre una placa de agar previamente solidificada.
Habitualmente se utilizan dos técnicas principales para el cultivo de bacterias en completa ausencia de oxígeno; son las técnicas de tubo rodante y las de cámara anaeróbica con guantes. El procedimiento del tubo rodante, se usa para obtener cultivos puros de anaerobios estrictos distribuyendo células en una fina capa de agar depositado en la pared de un tubo de ensayo, en donde se desarrollan como colonias aisladas. El tubo de ensayo es contiene unos pocos mililitros de medio con agar fundido que ha sido reducido químicamente para eliminar el oxígeno disuelto; el tubo es cerrado herméticamente con un tapón de goma de butilo . El agar fundido se inocula con diluciones apropiadas de la fuente de bacterias, introduciéndose a través de los tapones de goma con una jeringa estéril. Los tubos se depositan luego tumbados sobre hielo y se los hace rodar hasta que el agar se solidifica formando una capa fina en la pared del tubo. Después de un período de incubación, cuando las colonias aisladas se recogen con una aguja o con un tubo capilar. Siempre que se destapa un tubo, se impide la entrada de aire pasando continuamente una corriente de gas libre de oxígeno al interior del tubo.
Aislamiento de cultivos puros en medios líquidos.
Los métodos de siembra en placa son, en general, satisfactorios para el aislamiento de bacterias y hongos, porque la gran mayoría de los representantes de estos grupos pueden crecer bien en medios sólidos. Sin embargo, algunas de las bacterias de mayores tamaños celulares no han sido todavía cultivadas con éxito en medios sólidos. Sin embargo, algunas de las bacterias de mayores tamaños celulares no han sido cultivadas exitosamente en medios sólidos, y muchos protozoos y algas son sólo tambipen cultivables en medio líquido. Aunque los métodos de siembra en placa para el aislamiento de los virus se ha extendido mucho durante los últimos años, la manera más fácil de aislar todos estos organismos consiste en el uso de medios líquidos. En el caso de los virus, por supuesto que nunca se puede obtener un cultivo puro, ya que estos organismos son parásitos intracelulares obligados; un cultivo bimembre, formado por un virus específico y su hospedador biológico, representa la meta de purificación para este grupo.
El método de las diluciones: el inóculo se somete a una dilución en serie utilizando un medio estéril y e inocula un gran número de tubos de medio con partes alícuotas de cada una de las diluciones sucesivas. El objeto de esta operación es inocular una serie de tubos con una suspención microbiana tan diluída que la probabilidad de introducir siquiera un solo individuo dentro del tubo dado es muy pequeña.
El método de las dilucionestiene, sin embargo, una gran desventaja: sólo puede utilizarse para aislar el mienbro predominante numéricamente de una población microbiana mixta. Casi nunca puede ser utilizado de manera eficaz para el aislamiento de microorganismos grandes que no crecen en medios sólidos porque, por regla general, en la naturaleza estos microorganismos se hallan en un número muy inferior al de las bacterias. De ahí que el método de las diluciones sea limitado.
El método de las dilucionestiene, sin embargo, una gran desventaja: sólo puede utilizarse para aislar el mienbro predominante numéricamente de una población microbiana mixta. Casi nunca puede ser utilizado de manera eficaz para el aislamiento de microorganismos grandes que no crecen en medios sólidos porque, por regla general, en la naturaleza estos microorganismos se hallan en un número muy inferior al de las bacterias. De ahí que el método de las diluciones sea limitado.
Cuando no puede aplicarse ni el método de siembra en placa ni el de las diluciones, la única alternativa consiste en recurrir al aislamiento, microscópicamente controlado, de una sola célula. la dificultad técnica del aislamiento de una sola célula está en la razón inversa al tamaño del organismo que se quiere aislar; es relativamente fácil de usar con microorganismos de tamaño celular grande, tales como algas, pero resulta mucho más difícil con bacterias.
En el caso de microorganismos grandes, la purificación implica la captura de un solo individuo con una pipeta capilar y la subsiguiente transferencia de este individuo, a través de varios lavados en volúmenes relativamente grandes de medio estéril con el fin de eliminar los contaminantes microbianos de menor tamaño. Las operaciones sucesivas pueden realizarse a mano, controlándolas por observación microscópica directa a aumentos relativamente bajoss, tales como los que ofrece un microscópio de disección.
La técnica de la pipeta capilar no se puede aplicar di el organismo que se quiere aislar en tan pequeño que no puede ser observado con aumento de 100 diámetros o menos, ya que no se puede conseguir la finura del control necesaria para manipular directamente con una pipeta caplar a aumentos más elevados. En este caso, puede usarse un artificio mecánico conocido con el nombre de micromanipulador, junto con instrumentos de vidrio muy finos, especialmente preparados.
La técnica de la pipeta capilar no se puede aplicar di el organismo que se quiere aislar en tan pequeño que no puede ser observado con aumento de 100 diámetros o menos, ya que no se puede conseguir la finura del control necesaria para manipular directamente con una pipeta caplar a aumentos más elevados. En este caso, puede usarse un artificio mecánico conocido con el nombre de micromanipulador, junto con instrumentos de vidrio muy finos, especialmente preparados.
Cultivos bimembres
Contiene solamente dos clases de organismos. Un cultivo bimembre es la única forma posible para mantener los virus, ya que estos organismos son todos parásitos intracelulares obligados de organismos celulares. El parasitismo intracelular obligado es tambipen característico de varios grups de microorganismos celulares, en todos estos casos, un cultivo bimembre representala manera más ascequible que se puede conseguir para el cultivo bajo condiciones controladas de laboratorio.
Este tipo de cultivo se desarrolla en dos faces, primero es necesario establecer un cultivo puro del organismo que sirve de alimento.Una vez logrado esto, el parásito o depredador puede ser aislado por cualquiera de los diversos métodos descritos, e introducido en el cultivo puro del organismo que sirve de alimento.
El mantenimiento con éxito de los cultivos bimembres requiere de un gran cuidado ya que es esencial mantener un equilibrio biológico razonablemente estable entre los dos componentes. El medio debe de permitir el suficiente desarrollo del organismo que sirve de alimento para saciar las necesidades del parásito o depredador, pero no tanto que sobrepase en crecimiento a su asociado y origine productos metabólicos que sean perjudiciales para éste.
TEORÍA Y PRÁCTICA DE LA ESTERILIZACIÓN
La esterilización es un tratamiento que deja el objeto tratado libre de todo organismo vivo. Puede lograrse mediante la expocisión a agentes letales físicos o químicos o, en el caso especial de las disoluciones, por filtración.
Esterilización por calor.
El calor es el agente letal más ampliamente utilizado para la esterilización. Los objetos pueden ser esterilizados por calor seco, aplicado en un horno en atmósfera de aire o por calor húmedo, que proporciona el vapor caliente. De estos dos métodos, la esterilización por calor seco requiere una duración e intensidad mucho mayores porque la conducción del calor es menos rápida en aire seco que en aire húmedo. Además, las bacterias pueden sobrevivir en estado de desecación completa, y en este estado , la resistencia untrínseca al calor de las células vegetativas bacterianas está enormemente aumentada. Por consiguiente, la tasa de muerte es mucho más baja para las células desecadas que para las hidratadas.
El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. Los objetos se envuelven en papel o se les protege de otra forma de la contaminación posterior y son expuestos a una temperatura de 170°C durante 90 minutos en un horno.
Esterilización por tratamiento químico.
El requerimiento esencial para un agente químico esterilizante es que sea volátil así como tóxico, de manera que pueda ser fácilmente eliminado del objeto esterilizado después del tratamiento. El mejor candidato disponible es el óxido de etileno, un líquido que hierve a 10.7°C. Puede añadirse a las disoluciones en forma líquida a una temperatura de 0 a 4°C, o bien puede usarse como gas esterilizante a temperaturas por encima de su punto de ebullición. Sin embargo es químicamente inestable y se descompone en disolución acuosa dando etilenglicol, que no es volátil y puede tener efectos no deseables, por lo que sólo se usa en la industria para la esterilización de placas de Petri y de otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores a los 100°C.
Esterilización por filtración
El principal método de laboratorio usado para estelirizar disoluciones de materiales termolábiles es la filtración a través de filtros capaces de retener los microorganismos. La acción de estos filtros es casi siempre compleja. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes de los poros durante su paso a través del filtro. Sin embargo nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan una disolución libre de bacterias, se van a eliminar también los virus.
BIBLIOGRAFÍAEste tipo de cultivo se desarrolla en dos faces, primero es necesario establecer un cultivo puro del organismo que sirve de alimento.Una vez logrado esto, el parásito o depredador puede ser aislado por cualquiera de los diversos métodos descritos, e introducido en el cultivo puro del organismo que sirve de alimento.
El mantenimiento con éxito de los cultivos bimembres requiere de un gran cuidado ya que es esencial mantener un equilibrio biológico razonablemente estable entre los dos componentes. El medio debe de permitir el suficiente desarrollo del organismo que sirve de alimento para saciar las necesidades del parásito o depredador, pero no tanto que sobrepase en crecimiento a su asociado y origine productos metabólicos que sean perjudiciales para éste.
TEORÍA Y PRÁCTICA DE LA ESTERILIZACIÓN
La esterilización es un tratamiento que deja el objeto tratado libre de todo organismo vivo. Puede lograrse mediante la expocisión a agentes letales físicos o químicos o, en el caso especial de las disoluciones, por filtración.
Esterilización por calor.
El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. Los objetos se envuelven en papel o se les protege de otra forma de la contaminación posterior y son expuestos a una temperatura de 170°C durante 90 minutos en un horno.
Esterilización por tratamiento químico.
El requerimiento esencial para un agente químico esterilizante es que sea volátil así como tóxico, de manera que pueda ser fácilmente eliminado del objeto esterilizado después del tratamiento. El mejor candidato disponible es el óxido de etileno, un líquido que hierve a 10.7°C. Puede añadirse a las disoluciones en forma líquida a una temperatura de 0 a 4°C, o bien puede usarse como gas esterilizante a temperaturas por encima de su punto de ebullición. Sin embargo es químicamente inestable y se descompone en disolución acuosa dando etilenglicol, que no es volátil y puede tener efectos no deseables, por lo que sólo se usa en la industria para la esterilización de placas de Petri y de otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores a los 100°C.
Esterilización por filtración
El principal método de laboratorio usado para estelirizar disoluciones de materiales termolábiles es la filtración a través de filtros capaces de retener los microorganismos. La acción de estos filtros es casi siempre compleja. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes de los poros durante su paso a través del filtro. Sin embargo nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan una disolución libre de bacterias, se van a eliminar también los virus.
- Stainer, R. , Ingrahan, J. , Wheelis, M. y Painter, P. (1996). Microbiología. Barcelona: Reverté. 18- 23
hola, tengo una duda sobre el agar. ¿Cómo lo reduces químicamente?
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