Métodos de cultivo

TÉCNICA DEL CULTIVO PURO
Los microorganismos son obicuos, por lo  que la preparación de un cultico puro implica no sólo el aislamiento de un determinado microorganismo a partir de una población microbiana natural mixta, sino también el mantenimiento del individuo aislado y de su descendencia, en un ambiente artificial al que se le impide el acceso de otros microorganismos. Los microorganismos no requieren mucho espacio para su desarrollo; de ahí que pueda crearse un ambiente artificial dentro de los confines de un tubo de ensayo, de un matraz o de una placa de Petri, los tres tipos de recipientes más comúnmente utilizados para cultivar microorganismos. El recipiente de cultivo debe de estar inicialmente estéril y después de la introducción del tipo de microorganismo deseado debe estar protegido de una posterior contaminación externa. La superficie externa de un recipiente de cultivo está sometida a contaminación y el interior del matraz o del tubo puede contaminarse cuando se abre para introducir o retirar el material. Esto se evita pasando el orificio por una llama de mechero, inmediatamente después de retirar el tapón y, de nuevo, justo antes de volverlo a colocar.

El inóculo, se introduce normalmente con un hilo de metal o “asa” que es rápidamente esterilizada en una llama, inmediatamente antes de ser utilizada. La transferencia de cultivos líquidos puede hacerse también  con pipetas. Para este fin, el extremo de la pipeta por donde se aspira se tapona con algodón y la pipeta se esteriliza envuelta en papel o dentro de recipientes metálicos o de vidrio, que mantienen tanto la superficie externa como la interna, libres de contaminación hasta el momento de su utilización.

Aislamiento de cultivos por métodos de siembra en placa.

Este método implica la separación y la inmovilización de los microorganismos particulares sobre o dentro de un medio nutritivo solidificado por agar o algún otro agente gelificante adecuado. Cada organismo viable da origen, al multiplicarse, a una colonia de la cual pueden hacerse tranferencias fácilmente.

La siembra por estría es, en general, el método más útil de sembrar en placa. Un alambre con un aro en la punta, se esteriliza e introduce en una suspensión, convenientemente diluida, de organismos y se utiliza luego para hacer una serie de estrías paralelas, no superpuestas, sobre una placa de agar previamente solidificada.

La siembra por vertido, denominado “cultivo por dilución y agitación”. Un tubo con agar fundido y enfriado se inocula y se mezcla; aproximadamente la décima parte de su contenido se transfiere a un segundo tubo en el cual se mezcla a su vez y se utiliza para inocular un tercer tubo de la misma manera. Después de haber preparado de 6 a 10 diluciones sucesivas, los tubos se enfrían rápidamente y se cierran herméticamente vertiendo sobre la superficie una capa de vaselina y parafina, con el fin de evitar el acceso del aire a la columna de agar. En estos cultivos las colonias se desarrollan a profundidad dentro de la columna de agar, y por lo tanto no son tan fácilmente accesibles. Para hacer una transferencia de colonias se elimina el cierre de vaselina-parafina con una aguja estéril y la columna de agar se extruye del tubo soplando suavemente una corriente de gas libre de oxígeno a través de una pipieta capilar introducida entre la pared del tubo y el agar. La columna extruida se recoge en una placa de Petri estéril y se secciona en discos con una cuchilla estéril, a fin de permitir el examen y transferencia de las colonias.

 

Habitualmente se utilizan dos técnicas principales para el cultivo de bacterias en completa ausencia de oxígeno; son las técnicas de tubo rodante y las de cámara anaeróbica con guantes. El procedimiento del tubo rodante, se usa para obtener cultivos puros de anaerobios estrictos distribuyendo células en una fina capa de agar depositado en la pared de un tubo de ensayo, en donde se desarrollan como colonias aisladas. El tubo de ensayo es contiene unos pocos mililitros de medio con agar fundido que ha sido reducido químicamente para eliminar el oxígeno disuelto; el tubo es cerrado herméticamente con un tapón de goma de butilo . El agar fundido se inocula con diluciones apropiadas de la fuente de bacterias, introduciéndose a través de los tapones de goma con una jeringa estéril. Los tubos se depositan luego tumbados sobre hielo y se los hace rodar hasta que el agar se solidifica formando una capa fina en la pared del tubo. Después de un período de incubación, cuando las colonias aisladas se recogen con una aguja o con un tubo capilar. Siempre que se destapa un tubo, se impide la entrada de aire pasando continuamente una corriente de gas libre de oxígeno al interior del tubo.

Aislamiento de cultivos puros en medios líquidos.

Los métodos de siembra en placa son, en general, satisfactorios para el aislamiento de bacterias y hongos, porque la gran mayoría de los representantes de estos grupos pueden crecer bien en medios sólidos. Sin embargo, algunas de las bacterias de mayores tamaños celulares no han sido todavía cultivadas con éxito en medios sólidos. Sin embargo, algunas de las bacterias de mayores tamaños celulares no han sido cultivadas exitosamente en medios sólidos, y muchos protozoos y algas son sólo tambipen cultivables en medio líquido. Aunque los métodos de siembra en placa para el aislamiento de los virus se ha extendido mucho durante los últimos años, la manera más fácil de aislar todos estos organismos consiste en el uso de medios líquidos. En el caso de los virus, por supuesto que nunca se puede obtener un cultivo puro, ya que estos organismos son parásitos intracelulares obligados; un cultivo bimembre, formado por un virus específico y su hospedador biológico, representa la meta de purificación para este grupo.

El método de las diluciones: el inóculo se somete a una dilución en serie utilizando un medio estéril y e inocula un gran número de tubos de medio con partes alícuotas de cada una de las diluciones sucesivas. El objeto de esta operación es inocular una serie de tubos con una suspención microbiana tan diluída que la probabilidad de introducir siquiera un solo individuo dentro del tubo dado es muy pequeña.
El método de las dilucionestiene, sin embargo, una gran desventaja: sólo puede utilizarse para aislar el mienbro predominante numéricamente  de una población microbiana mixta. Casi nunca puede ser utilizado de manera eficaz para el aislamiento de microorganismos grandes que no crecen en medios sólidos  porque, por regla general, en la naturaleza estos microorganismos se hallan en un número muy inferior al de las bacterias. De ahí que el método de las diluciones sea limitado.

Cuando no puede aplicarse ni el método de siembra en placa ni el de las diluciones, la única alternativa consiste en recurrir al aislamiento, microscópicamente controlado, de una sola célula. la dificultad técnica del aislamiento de una sola célula está en la razón inversa al tamaño del organismo que se quiere aislar; es relativamente fácil de usar con microorganismos de tamaño celular grande, tales como algas, pero resulta mucho más difícil con bacterias.

En el caso de microorganismos grandes, la purificación implica la captura de un solo individuo con una pipeta capilar y la subsiguiente transferencia de este individuo, a través de varios lavados en volúmenes relativamente grandes de medio estéril con el fin de eliminar los contaminantes microbianos de menor tamaño. Las operaciones sucesivas pueden realizarse a mano, controlándolas por observación microscópica directa a aumentos relativamente bajoss, tales como los que ofrece un microscópio de disección.
La técnica de la pipeta capilar no se puede aplicar di el organismo que se quiere aislar en tan pequeño que no puede ser observado con aumento de 100 diámetros o menos, ya que no se puede conseguir la finura del control necesaria para manipular directamente con una pipeta caplar a aumentos más elevados. En este caso, puede usarse un artificio mecánico conocido con el nombre de micromanipulador, junto con instrumentos de vidrio muy finos, especialmente preparados.

Cultivos bimembres

Contiene solamente dos clases de organismos. Un cultivo bimembre es la única forma posible para mantener los virus, ya que estos organismos son todos parásitos intracelulares obligados de organismos celulares. El parasitismo intracelular obligado es tambipen característico de varios grups de microorganismos celulares, en todos estos casos, un cultivo bimembre representala manera más ascequible que se puede conseguir para el cultivo bajo condiciones controladas de laboratorio.
Este tipo de cultivo se desarrolla en dos faces, primero es necesario establecer un cultivo puro del organismo que sirve de alimento.Una vez logrado esto, el parásito o depredador puede ser aislado por cualquiera de los diversos métodos descritos, e introducido en el cultivo puro del organismo que sirve de alimento.
El mantenimiento con éxito de los cultivos bimembres requiere de un gran cuidado ya que es esencial mantener un equilibrio biológico razonablemente estable entre los dos componentes. El medio debe de permitir el suficiente desarrollo del organismo que sirve de alimento para saciar las necesidades del parásito o depredador, pero no tanto que sobrepase en crecimiento a su asociado y origine productos metabólicos que sean perjudiciales para éste.


BIBLIOGRAFÍA

- Stainer, R. , Ingrahan, J. , Wheelis, M. y Painter, P. (1996). Microbiología. Barcelona: Reverté. 18- 20.